细胞凋亡检测是生物医学研究中一项至关重要的技术，它被广泛应用于疾病机制研究和药物筛选等领域。本文将详细介绍如何使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会从胞质转移到胞外，暴露在细胞外环境中，并导致细胞膜通透性增加。此时，PS特异性的Annexin-V探针能够标记这些细胞。Annexin-V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，具有对PS的强烈结合能力。相对而言，PI是一种经济且稳定的核酸染料，它无法穿透健康细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以穿透晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，使其细胞核被染红。当将Annexin-V和PI联合使用时，活细胞和早期凋亡细胞将被排除在外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞则会被FITC和PI同时标记，呈现双阳性结果。

实验材料准备

• AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：以1000g离心5分钟，弃去上清液。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用，加入PBS洗涤后，适量胰酶消化液消化细胞（建议使用不含EDTA的胰酶）。加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞，制得单细胞悬液，1000g离心5分钟，弃去上清。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

加入195μL Binding Buffer，轻柔重悬细胞，使其达到适宜浓度。

3. 添加染料

• 加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。
• 加入10μL PI Stain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以使染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适当的通道，检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 对照设置非常重要，可以帮助校正背景信号和确定凋亡细胞的比例：
   • 未染色组：检测自然荧光。
   • PI单染组：确定PI的阳性阈值。
   • AnnexinV-FITC单染组：确定AnnexinV的阳性阈值。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞，并涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC显示绿色荧光，而PI显示红色荧光。
3. 通过拍照或计数定量分析凋亡细胞的比例。

注意事项

• 整个操作过程中应尽量保持低温，以减少细胞代谢和染色过程中的自发荧光。
• 避免长时间暴露于光线下，特别是针对FITC类染料，因为光照会造成荧光淬灭。
• 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
• 在使用流式细胞仪时，确保仪器已校准并且通道设置正确。

通过细胞凋亡检测，研究人员能够深入了解细胞死亡的机制。这项技术的实施也得益于尊龙凯时产品的高效性和准确性，为生物医学研究提供了可靠的支持。