近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得了显著突破。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法成功攻克了血液瘤的难题，同时基于AAV载体的基因疗法也为罕见病患者提供了新的希望。此外，CRISPR基因编辑技术的迅猛发展为基因治疗打开了新的篇章，体外的基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内的基因编辑疗法也展现出了良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题引发了广泛的关注。由于其对基因组DNA的直接操作，任何不准确的修改都有可能引发长期风险。对此，FDA等监管机构出台了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两个方面：一是基因组完整性的评估，涉及染色体重排、大片段插入或缺失及外来DNA整合的潜在致癌性；二是脱靶编辑活动的识别，包括类型、频率和位置。

为确保基因编辑的安全性和有效性，研究人员已经开发了多种检测和评估脱靶效应的方法。根据实验条件，这些检测方法可分为体内和体外两类。

体内脱靶检测方法

体内检测方法在活细胞或生物体内评估脱靶效应，这些方法通常能更真实地反映生物学情况。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种强大的工具，用于检测CRISPR-Cas9系统的脱靶效应。其基本原理是通过向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物能够插入Cas9产生的DNA双链断裂位点，随后利用高通量测序技术识别这些标记的位点，从而全面发现潜在的脱靶编辑位置。

优点：提供全基因组水平的脱靶位点信息；直接检测体内真实的双链断裂事件。

缺点：实验操作相对复杂，要求较高技术水平；可能会错过某些不易被标记物插入的脱靶位点。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑中脱靶效应的创新方法，通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来识别潜在的脱靶位点。

优点：实时监控Cas9-DNA相互作用，提供非侵入式的检测手段。

缺点：实验设计复杂，需要特定设备。

体外脱靶检测方法

体外检测方法通常在实验室中进行，使用提取的生物体成分或合成材料，这样能对特定因素进行精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，全面检测CRISPR-Cas9系统的脱靶效应。该方法通过模拟Cas9对纯化基因组DNA的切割，并对消化后的DNA进行全基因组测序，利用生物信息学工具定位可能的脱靶编辑。

优点：高效识别全基因组范围内的脱靶位点。

缺点：可能会遗漏细胞内特有的脱靶事件。

其他体外检测技术

如SITE-Seq和CIRCLE-seq等技术不断地在改进脱靶检测的灵敏度和背景信号问题。这样的创新使得基因编辑的安全性评估变得更加可靠。

总的来说，在生物医疗领域，无论是基础研究还是临床应用，CRISPR技术都展现出了巨大的潜力与风险，尤其是对脱靶现象的关注。本文详尽介绍了多种主流的CRISPR脱靶检测方法。然而，没有一种单一的方法能适用于所有情况。在实际操作，尤其是在临床试验中，全面评估CRISPR的脱靶风险需要结合多种检测技术。

尊龙凯时在基因编辑安全性评估方面也不遗余力，构建了一站式的基因编辑评估平台，涵盖了多个关键检测环节。这使得我们能够提供更可靠、高效和安全的基因编辑服务和产品，推动生物医疗领域的持续进步。